裸鼠皮下成瘤实验作为肿瘤研究领域的经典模型，通过将人类肿瘤细胞移植至免疫缺陷小鼠体内，为抗肿瘤药物筛选、免疫治疗机制研究提供了关键技术支持。

然而，实验中肿瘤生长不稳定、均一性差等问题频发，导致数据可靠性降低。

本文系统梳理5大核心问题及解决方案，结合标准化操作流程，助力研究者突破实验瓶颈。

一、五大常见问题

肿瘤先缩小后消失

炎症反应与细胞存活的双重挑战

实验中出现肿瘤先缩小后消失的现象，这主要源于两方面的机制：一是移植初期引发的局部炎症反应导致细胞被宿主吸收；二是接种细胞数量不足或活力低下。

若观察3周后肿瘤仍未复长，需更换免疫缺陷程度更高的小鼠（如NSG模型），其缺乏NK细胞、B/T细胞，可显著提升移植成功率。

肿瘤均一性失控

周龄与接种量的双重变量

正常情况下，部分肿瘤细胞（如黑色素瘤 B16）本身生长形态不规则，体积存在轻微差异（误差≤20%）无需干预。

若同组裸鼠肿瘤体积差异超过30%时，需重点排查两大因素：

周龄混养：4周龄与8周龄小鼠代谢速率差异显著，导致肿瘤生长速度不同步。

接种量偏差：细胞计数误差或注射技术不稳定（如部分小鼠注射量达5×10⁶，而其他仅1×10⁶）对于黑色素瘤等本身形态不规则的肿瘤，需建立误差容忍标准（≤20%），避免过度干预 。

生长迟缓困境

免疫抑制与细胞活性的平衡

当肿瘤生长速率低于预期时，可谨慎使用环磷酰胺（50mg/kg，每周1次）抑制裸鼠残留T细胞活性，进一步降低免疫排斥，从而加速肿瘤生长，但需严格把控剂量，否则可能出现：过度抑制，导致感染风险激增。

这种方法仅适用于常规成瘤失败案例，健康模型无需干预，同时建议同步检测细胞活力（台盼蓝染色）及支原体污染情况。

多点荷瘤禁忌

营养竞争与形态干扰的连锁反应

实验设计应坚持"一鼠一瘤"原则，单只小鼠多部位接种会引发三大问题：

肿瘤间血管生成竞争导致生长抑制；

机械挤压造成形态扭曲，影响体积计算准确性；

代谢负担加重，缩短小鼠生存期；

接种后无瘤

细胞、宿主与技术的三角排查

若7-10天仍未形成可见肿块，需重点排查：

细胞因素：活力检测（Trypan Blue排除率＜5%）、成瘤能力验证（换用PC-3等高成瘤系）。

宿主因素：周龄优化（4-6周最佳），更换重度免疫缺陷的小鼠（Nod-scid或NSG替代裸鼠）。

技术因素：加入Matrigel基质胶辅助（1:1混合细胞悬液），增加注射的细胞数量或更换易成瘤的细胞系。

二、标准化操作流程

1. 细胞准备阶段

选用对数生长期细胞（密度80-90%）。

PBS清洗3次，去除血清干扰。

0.25%胰酶消化细胞后，用PBS或者无血清培养基重悬细胞并进行细胞计数，计算所需的终浓度。

细胞计数调整至终浓度：通常皮下瘤接种时，使用的细胞量为每支1-5×10⁶个细胞，接种体积为0.1毫升。

2. 细胞接种阶段

选用5-8周龄（18-20g）裸鼠，优先选择腋窝中后部、腹股沟中上部供血丰富区域进行接种。

在接种前，使用枪将细胞悬液充分吹散，以确保细胞均匀分散，防止细胞聚集降低其存活率。

注射前将细胞悬液放置在冰上，以减缓细胞凋亡。

用左手固定裸鼠后，45°角进针，深入皮下1cm后回抽，无血，再注射。

注射体积严格控制在100μl，推注时间＞5秒。

3. 细胞接种后

接种完成每日观察小鼠活动状态及注射部位变化，大约1周后可以观察到肿瘤的形成。

肿瘤长出后，每日用游标卡尺测量肿瘤长径与短径。

伦理终点设定：当肿瘤体积达1000mm³或出现溃疡时实施安乐死，并取出肿瘤进行后续处理分析检测。

4. 样本处理规范

液氮冻存组（-80℃过渡后长期保存，可提取蛋白质和RNA）。

福尔马林固定组（4%中性缓冲液固定24-48小时，用于免疫组化免疫荧光等实验） 。

同步留取血液样本（EDTA抗凝管）。

通过系统规避5大核心问题，结合标准化操作流程与质量控制体系，裸鼠皮下成瘤实验的成功率可稳定提升至90%以上。

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